常見問題
原因1：樣本中的雜蛋白影響了介質與目的蛋白的親和
原因 | 解決方案 |
大部分雜蛋白分子量小于目的蛋白，可能是目的蛋白降解 | 1.裂解過程中加入蛋白酶抑制劑（如PMSF） 2.降低超聲破碎的功率和時間 |
雜蛋白與目的蛋白相互作用，共同被洗脫 | 細胞破碎前加低濃度還原劑或去污劑減少非特異性作用 |
雜蛋白與介質親和力太強 | 提高樣品介質結合起始咪唑濃度 |
樣品中含有其他的組氨酸標簽蛋白 | 1.調節pH或咪唑濃度優化洗雜條件； 2.使用多步純化法進一步純化洗脫組分（如離子交換，疏水等）； 3.使用雙標簽純化（如同時在重組蛋白上添加His標簽和Strep II標簽） |
原因2：操作或介質選擇不當
原因 | 解決方案 |
洗雜操作不徹底 | 增加Wash Buffer體積 |
介質中金屬離子選擇性較弱 | 優化過渡金屬離子種類：可以采用選擇性更高的Co2+作為過渡金屬離子，使得含有組氨酸的雜蛋白無法吸附在介質上 |
介質中配體選擇性較弱 | 優化層析介質種類：可以采用純度較高的Smart介質代替IDA與NTA作為層析介質 |
原因1：目的蛋白不掛柱
原因 | 解決方案 |
菌體未裂解 | 判斷方法：取裂解上清，電泳檢測是否含有目的蛋白 1.調整超聲功率2.改變裂解方式（如化學裂解法） |
蛋白表達為包涵體 | 參考包涵體純化方法 |
His標簽斷裂丟失 | 判斷方法：通過WB檢測His標簽 1.調整破碎條件，加入蛋白酶抑制劑 2.His標簽設計在蛋白N端 |
標簽未充分暴露 | 1. 參考包涵體純化方法，在蛋白中加入適量的尿素或鹽酸胍等變性劑使標簽暴露。 2. 改變His標簽位置或增加His標簽長度提高標簽暴露 |
目的蛋白表達量低 | 優化表達條件（查） |
原因2：目的蛋白結合弱
原因 | 解決方案 |
目的蛋白在洗雜步驟被洗脫 | 判斷方法：電泳檢測洗雜液中是否含有目的蛋白 1.降低Wash Buffer中咪唑濃度； 2.增加Wash Buffer的pH； 3.延長結合時間，改變結合條件 |
介質中金屬離子結合力較弱 | 優化過渡金屬離子種類：可以采用結合力更強的Cu2+作為過渡金屬離子，增加目的蛋白與介質間結合作用 |
純化介質中Ni2+被剝離 | 1.如填料顏色變淺，可通過填料再生，重新掛Ni2+ 2.如緩沖液中含有DTT、EDTA等試劑，調整試劑濃度或者選擇Ni NTA Beads 6FF/Ni Smart Beads 6FF |
原因3：目的蛋白洗脫不下來
原因 | 解決方案 |
洗脫條件太溫和 | 1.提高Elution Buffer中咪唑濃度 2.降低Elution Buffer的pH |
目的蛋白結合力太強導致咪唑無法競爭洗脫 | 1.可采用螯合能力弱的Co2+作為過渡金屬離子，降低目的蛋白與介質間結合作用； 2.減少蛋白與介質結合時間 |
目的蛋白形成聚集體遮擋結合位點使咪唑無法競爭洗脫 | 選擇EDTA脫鎳洗脫，再通過透析或超濾換液方式去除EDTA、Ni2+和DTT |
蛋白與介質發生非特異性疏水或其他相互作用 | 1.在洗脫液中加入非離子型去污劑； 2.增加NaCl的濃度 |
上樣過程中蛋白發生沉淀 | 1.常規結合溫度：16-28℃，也可以選擇低溫結合：2-8℃ 2.若蛋白發生聚集，可在樣品和所有的緩沖液中添加穩定劑（如0.1％的Triton X-100或Tween-20） |
緩沖液pH≥目的蛋白pI 0.5-3個單位，蛋白帶負電，選擇弱陰離子交換填料(DEAE)；
緩沖液 pH≥目的蛋白pI 3個蛋白以上，蛋白帶負電，選擇強陰離子交換填料(Q)；
緩沖液 pH≤目的蛋白pI 0.5-3個單位，蛋白帶正電，選擇弱陽離子交換填料(CM)；
緩沖液 pH≤目的蛋白pI 3個單位以上，蛋白帶正電，選擇強陽離子交換填料(SP)；
緩沖液中含有較高離子強度時選擇復合型離子交換填料(MMC/MMA)。
強陰/陽離子交換劑：適用pH范圍廣，pH范圍內結合效果更穩定；
弱陰/陽離子交換劑：適用pH范圍窄，載量隨著pH變化，分辨率較高；當用強陰/陽離子無法滿足分離效果時，可以選擇。
Streptactin Beads 4FF建議用脫硫生物素洗脫，不能用D-生物素洗脫，原因是D-生物素與填料結合非常緊密，高濃度氫氧化鈉清洗后載量只能達到初始載量的 50%左右。每次用完都需要再生。
STarm Streptactin beads 4FF洗脫液為D-生物素，可以耐受高鹽和變性劑等試劑，也可以在微量游離生物素濃度下結合目的蛋白。使用完后可以用PBS進行清洗，無需每次再生。
Streptavidin Beads 6FF適用于生物素化蛋白、抗體等組分的親和；
Streptactin Beads 4FF適用于Strep-tag Ⅱ標簽融合蛋白、Twin Strep-tag Ⅱ標簽融合蛋白的親和。
IDA | NTA | Smart | |
載量 | 較高 | 較高 | 較低 |
蛋白純度 | 較低 | 中等 | 較高 |
耐受試劑 | 常規純化試劑，不耐受還原劑，變性劑，EDTA等 | 耐受低濃度還原劑，EDTA和變性劑 | 耐受一定濃度還原劑，EDTA，變性劑和氫氧化鈉 |
純化樣本 | 原核可溶蛋白 | 原核可溶蛋白或包涵體 | 真核胞內外蛋白，無需換液 |
再生方法 | 脫鎳再生 | 脫鎳再生 | 氫氧化鈉清洗 |
適用性 | 載量高，性價比高 | 適用性更廣，配體更穩定，選擇性更高 | 很強的組分兼容性，適用于廣泛底物及鹽濃度的緩沖條件 |
（1）血清可先用Protein G預處理，在培養前除去IgG。或選用IgG含量較低的血清。
（2）樣品先用Protein A或G純化，得到的抗體再經過疏水層析除去牛IgG。
（1）首先看樣品是否結合，抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力，結合緩沖液pH是否中性，流穿中抗體是否有減少，可將原始樣品和流穿同時跑SDS-PAGE電泳進行分析。
（2）再看樣品是否與填料結合太牢固，沒有洗脫下來，建議用pH更低的緩沖液洗脫。
（3）洗脫后酸性條件下抗體是否水解，可在收集管中預先加入中和液或精氨酸等保護劑，或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。
（1）洗雜是否完全？可取zui后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進行分析。
（2）適當提高結合時鹽離子濃度，或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑，降低非特異性吸附。
（3）上樣前樣品預處理，除去部分雜質。
（4）采用兩步純化，先親和層析純化，后經離子交換層析，除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等，得到純度更高的抗體。
（1）Protein L可以特異性的結合抗體的κ輕鏈，因此，只要Fab 片段中含有κ輕鏈，就可以選擇Protein L填料進行純化。
（2）Protein G 除了可以特異性結合IgG 的Fc 片段，還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結合。
（3）Protein A只結合IgG的Fc片段。采用流穿模式，將純的IgG酶解后過Protein A填料，Fab在流穿峰，Fc片段結合在填料上。
（1）更換親和力更高的填料。
（2）對于Protein A填料，結合pH可以升至8-9。
（3）填料多次使用后殘留物增多，載量降低，建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。
（1）通常采用沉淀法結合凝膠過濾法純化IgM，但對于大量純化抗體，這種方案繁瑣且產量低。
（2）采用Protein L親和填料，特異性的結合κ輕鏈，對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。
（3）嗜硫填料是根據其配基與抗體間的二硫鍵產生特異性相互作用，中性條件下吸附、洗脫，純化后蛋白活性高，是一種通用型抗體純化手段。
最常用的預處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白，常用硫酸右旋葡糖酐沉淀，或是在pH=7時，采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白，可以使用分級沉淀法去除，如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。
